产品名称:外泌体提取纯化试剂盒(组织)

英文名称:Exosome Isolation and 

    Purofication Kit (from Tissue)

货号规格:UR52161(20 T)

运输存储:Solution A2冰袋运输,存储于-18℃以下;其他组分常温运输存储。有效期2年。

产品描述:

外泌体是由细胞分泌的包含RNA和蛋白质的小囊泡(30-150 nm),在血液、唾液、尿液及乳汁等体液以及组织中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能,在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子;然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。

外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒,而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。宇玫博生物自主开发的外泌体提取纯化试剂盒(组织),组分经过优化处理,适用于多种组织的外泌体提取(包括脑、心、肝、肺、肌肉、脾、淋巴结、胸腺、胚胎、肿瘤等组织),可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒,可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

自备材料:

高速离心机(可达到12000 ×g转速),涡旋振荡器,1.5 mL、2 mL离心管,PBS缓冲液。

产品组成:

操作规程:

一、样品预处理

1.提前将Solution A2置于4℃或冰上融化并混匀;

2.组织剪碎:在消毒器皿(置于冰上)中将组织剪切成1 mm3～3 mm3左右的碎组织块 (组织块剪切得越小越好);

3.组织碎片清洗:将组织碎块转移至2 mL离心管中,加入不少于10倍体积的1×PBS缓冲液,振荡混匀后300×g(~2000 rpm*)离心10分钟,弃上清;

* 为约7 cm有效离心半径的离心机换算,下同。

4.组织消化:按照每0.1 g组织块加入1 mL Solution A2的比例,将组织块与Solution A2混匀,横放于37℃、80 rpm恒温摇床上孵育20分钟(或在37℃水浴锅中孵育20分钟,每5分钟混匀一次);

5.离心:反应液以8000×g(~10000 rpm)离心10 min,将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。

二、外泌体提取纯化

1.加Solution B2试剂:上一步获得的上清液中加入1/4体积的Solution B2试剂;

2.溶液混合:通过涡旋振荡器混匀1 min;

3.静置:混匀后的样品于4℃环境中静置20分钟; 

4.沉淀外泌体:将静置后的样品于4℃以8000×g(~10000 rpm)离心20 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒(注:尽可能吸净上清液); 

5.外泌体重悬:加入1×PBS均匀吹打离心沉淀物(按照每0.1 g组织对应200 μL PBS的比例进行重悬),待其溶解后,将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中;

6.收获外泌体颗粒:将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以11000×g(~12000 rpm)离心2 min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒(注:此时可能仍有较多沉淀,为正常现象);

7.外泌体纯化:将外泌体转移至纯化柱(Exosome Purification Filter)中,于4℃以3000×g(~6000 rpm)离心10 min,下柱中的样品即为纯化后的外泌体(注:EPF柱不可重复使用);

8.外泌体的保存:纯化后的外泌体以50-100 μL进行分装保存于-80℃低温冰箱中,以备后继实验使用。

注意事项:

本产品仅用于生命科学研究,不得用于医学诊断及其他用途!更多技术问题,请联系宇玫博为您作进一步解答。

常见问题及解决方法:

一、产品试剂保存问题:

1.Solution A2使用前后应保存于-18℃条件下,建议分装后使用,应避免反复冻融;

2.Solution B2始终保存在室温条件下即可,温度过低可能使该溶液中出现白色结晶,且难以复溶(需要高温),少量沉淀不影响提取效果。

二、纯化柱使用问题:

1.一般情况下,每个样品按照说明书操作,“3000×g(~6000 rpm)离心10 min”即可一次性纯化完毕。如果上柱中仍有液体残留,将纯化柱转换方向放置于离心机中(区别于上一次放置方向即可),再次重复离心;

2.若通过上述操作,上柱中仍有较多液体残留,请将上柱中的液体转移至新的纯化柱中,继续重复离心操作,直至上柱液体全部转移至下柱中。

三、外泌体得率问题:

一般情况下,0.1 g组织样品(以心肌组织为例)可以提取出100~200 ug外泌体(5E+9~1E+10 Particles总量),因不同组织外泌体含量不同,得率会有一定差异。